Divulgación y Conocimiento Libre

Hola a todos,
he tenido un pequeño problema con mis pipetas de PCR y se han contaminado el set de dNTPs. La cuestión es que son muy caros ya que no es un mix, los compré por separado. Sabe alguna persona como descontaminar los dNTPs sin estropearlos??

quote:127def0cba=%22Anonymous%22Hola a todos,
he tenido un pequeño problema con mis pipetas de PCR y se han contaminado el set de dNTPs. La cuestión es que son muy caros ya que no es un mix, los compré por separado. Sabe alguna persona como descontaminar los dNTPs sin estropearlos??/quote:127def0cba

http://biologi.uio.no/bot/ascomycetes/PCR.troubleshooting.html

Algernon

Muchas gracias, pero todo esto ya lo he leido antes, me parece que mi pregunta no la has entendido. En este link te habla de que hacer para evitar la contaminación y no de como descontaminar los dNTPs, que es lo que yo he preguntado. La PCR carry-over ya la utilizo y ya he leido de precaución mucho. Muchas gracias de todas formas.

Ahora dame tu opinión. He pensado que podría usar un Kit de purificación de producto de PCR, como por ejemplo el de qiagen pero usarlo de forma inversa, es decir intentar que mi contaminación se quede en la columna y mis dNTPs salgan eluidos de ella, que crees?? es buena idea? por probar no pierdo nada!!!!

Gracias

yo no soy biólogo ni bioquímico ni médico, etc..., sino químico, pero columnas usamos bastantes

si tu compras unas columnas para eliminar los reactivos que hacen la PCR, si los pasas solos (sin producto de PCR, pero con el contaminante), la columna seguirá quedándose con esos reactivos, y no sabes que hará el contaminante. Luego tienes que tener en cuenta si luego puedes eluir los reactivos y si, una vez eluidos, éstos son como al principio o la columna los ha "destrozado".

quote:7273e388cf=%22Anonymous%22Muchas gracias, pero todo esto ya lo he leido antes, me parece que mi pregunta no la has entendido./quote:7273e388cf
Yo es que soy psicólogo :P

Lo de los kits de Qiagen tiene buena pinta.

Algernon

psicólogo???Buena búsqueda porque no se como sabrás de PCRs.

Muchas gracias a todos, creo que lo intentaré con una dilución de los dNTPs y el Kit a ver que sale.
Saludos

quote:6de4ee25fc=%22Anonymous%22psicólogo???Buena búsqueda porque no se como sabrás de PCRs/quote:6de4ee25fc
Soy un psicólogo raro. Estoy metido en temas de genética de la conducta ;)

Algernon

quote:eb73fe8592Hola a todos,
he tenido un pequeño problema con mis pipetas de PCR y se han contaminado el set de dNTPs. La cuestión es que son muy caros ya que no es un mix, los compré por separado. Sabe alguna persona como descontaminar los dNTPs sin estropearlos??/quote:eb73fe8592

Con qué se te han contaminado? Puede q te funcione lo de la columna si se te ha contaminado con DNA grande pero las columnas no suelen retener fragmentos menores de 100pb, esto lo tienes q tener en cuenta. Si se te ha contaminado con productos PCR menores de 100pb creo q no te va a servir lo de la columna.

Tb podrías hacer un gel de agarosa y el exceso de dNTPs se te quedará al frente del gel, separándose de tu contaminante. Luego podrías recortar la banda de agarosa con los dNTPs y purificarlos, aunque no sé qué rendimiento obtendrías, ya q seguramente te dejes un montón por el camino...

Ya, también pensé en eso, pero me parece mucho riesgo. Mi fragmento es más grande de 100pb pero no mucho más 150pb aproximadamente, la cuestión es que no se si la contaminación es de DNA genómico o de mi producto de PCR. Aunque creo más bien que es genómico porque uso PCR carry-over y se lo comería mi Uridil-glicosidasa si fuese del producto.
Lo que pasa que no puedo usar el Buffer del Kit de unión de DNA que tiene Qiagen, porque entonces si que se estropean mis dNTPs. Pensando que el DNA se retiene por el poro de la columna, ¿¿¿¿no???, quizás añadiendo la dilución de dNTPs directamente se eluyen solo éstos y sería genial :lol:

Siento ser negativo, pero creo que no hay forma de descontaminar los dNTPs. No hay manera de purificarlos con una columna de Qiagen, a parte de que te los cargarias con los reactivos que se usan...
Lo unico seria lo del gel de agarosa, pero realmente me parece una guarreria y al final creo que seria peor el remedio que la enfermedad...

es cierto q lo del gel de agarosa es una guarrería...
tb se me ocurre q si sabes q tu contaminante es gDNA podrías utilizar DNasa para cargártelo; tpco sé como la DNasa afecta a los dNTPs.... por si te sirve de algo...

BUENO, EL KIT DE QIAGEN SE BASA EN DOS COSAS PARA RETENER EL DNA QUE EN MI CASO AHORA ES LA CONTAMINACION:
1º QUE EL BUFFER DE UNIÓN (EL QUE LLAMA PB) DEBE TENER UNA CONCENTRACION ALTA DE SALES CAOTROPICAS, ES DECIR,QUE ESTAS SALES DEBEN GENERAR AGLOMERACIONES DEL DNA PARA QUE SE UNA A LA COLUMNA. ESTO VERDADERAMENTE NO LO SE, PORQUE NO SE SI MIS DNTPS TIENE ESTA CONCENTRACIÓN SALINA, ME IMAGINO QUE NO PORQUE AFECTARIA A MI PCR.
2ºQUE EL PH SEA IGUAL O MENOR DE 7,5. COSA QUE SE QUE ES ASI PORQUE MIS DNTS TIENEN PH 7.

AUN NO LO HE INTENTADO. PERO HE LEIDO QUE INCIDIENDO CON UV A 250NM PUEDO DESTRUIR EL DNA SI AFECTAR A ALGUNOS COMPONENTES DEL MIX DE PCR. PERO ALGUNOS NO INLUYEN DNTPS Y OTROS DICEN QUE SE PUEDE IRRADIAR. HOY LO HE INTENTADO, YA OS DIRÉ QUE PASA. SI ESTO NO SALE INTENTARE LO DE LA COLUMNA.
GRACIAS. POR FAVOR DAR OPINIONES

Desde mi punto de vista la unica solucion que tienes es comprar un tubo nuevo de dNTPs y por supuesto utilizar una disolucion para hacer tus PCR distinta de tu stock.

Todo eso de la columna, incluso aunque teoricamente funcionara, al final te ocasionaria otros problemas, estoy seguro. Una solucion es contactar con una laboratorio de donde estes (en otra facultad o donde sea) y pedir una alicuota.

Yo cuando compro mis dNTPs, tienes para miles de reacciones. Calculo yo que para mi doctorado tendre de sobra con uno solo. Con lo cual en algun otro laboratorio seguramente te podran dar para 100 reacciones o mas, seguro que tienen en exceso y que no les importe demasiado.

Otra cosa siempre importante (cuando no te sobra la pasta y el reactivo es caro) es hacer alícuotas de uso (con cantidad suficiente para unas cuantas pero no demasiadas reacciones). Si como decís utilizais dNTPs para casi toda una vida, lo 1º q se debería hacer es alicuotarlos y guardarlos así, e ir descongeándolos poco a poco.

Amen.

quote:b7e6204463=%22RN%22Otra cosa siempre importante (cuando no te sobra la pasta y el reactivo es caro) es hacer alícuotas de uso (con cantidad suficiente para unas cuantas pero no demasiadas reacciones). Si como decís utilizais dNTPs para casi toda una vida, lo 1º q se debería hacer es alicuotarlos y guardarlos así, e ir descongeándolos poco a poco./quote:b7e6204463

Je, je, yo no quise mencionar esto por no ofender al que planteo la cuestion con cosas tan basicas. Si el chico utiliza PCR y columnas y demas, asumo que lo de hacer alicuotas lo tendra mas que aprendido.

Incluso no esta mal hacerlo con reactivos baratos como el MgCl, asi en caso de contaminacion en tu control, los tiras todos y coges un nuevo set de alicuotas (y no pierdes tiempo intentando descubrir la causa).

Nunca sobra la pasta, pero aprobecho todo al máximo, eso es lo que me han enseñado.
Lo de las alicuotas lo hago, lo malo es que cuando se te contaminan las pipetas y da la casualidad que haces las alicuotas ese día...(muy mala suerte, ya que no tengo pipetas para post-PCR y pre-PCR) se te joooood....todo.
Muchas gracias a todos.
Por si a alguién le pasa lo de irradiarlos con UV funciona y no los estropea, pero hay que probar con distintos tiempos.

Bueno, yo no sé si alguien miró los precios:

dNTPs (Ultra Pure Grade)
Leading Supplier of Bulk dNTPs,
$14-$20/ml (25mM Each)
NO sé si esto es caro o barato para ti, pero te aseguro que más económico que el kit de qiagen
Te aconsejo comprar nuevos y aliquotear (suelen proporcionarlos a esta concentración y se diluyen como 100 veces)
No sé, extraña PCR la tuya sin mezclas!!!

Bueno, los dNTPs comprados con mezcla son bastante baratos. Ahora dedicate a buscar cuanto valen los dUTPs, dCTPs,dATPs, dTTPs y dGTPs comprados por separado. Los necesito para hacer un tipo de PCR en la cual cambio el dTTP por dUTP, se llama PCR carry-over, y es una PCR para evitar la contaminación precisamente, pero la contaminación con tu producto de PCR y no con gDNA. Puedes buscarlo en google : prevention carry-over.
Y mis dNTPs los trajo mi jefa de EEUU en gran cantidad, el bote tendrá 2 ml por cada dNTP, es bastante verdad??? ahora me comprendes?

gran p***** lo de q se te contamine al alicuotar...!!! :?

todo depende de la cantidad de dNTPs que necesites, pero se pueden encontrar sets donde cada dNTP viene en un tubo separado para que tu hagas despues la mezcla, por menos de 100 euros.... lo cual no suele supone demasiado coste para un laboratorio ya que cada set da para bastante. Como ya te han dicho por aqui, te sale bastante mas barato comprarte unos nuevos que usar el kit de quiagen.